Он воспитывался в пуританской семье, находившейся в оппозиции как к господствовавшей в стране англиканской церкви, так и к абсолютной монархии Карла I.
Отец Локка во время гражданской войны был капитаном эскадрона в парламентской армии Кромвеля. Он владел значительным состоянием, но во время войны лишился большой части своих сбережений, — скорее всего, вследствие щедрости и великодушия, о которых часто упоминал его знаменитый сын. О матери Локка, урожденной Кинг, сведений мало.
В юношеские годы Джон Локк находился под влиянием политических идеалов отца, который отстаивал суверенитет народа, осуществляемый через парламент.
Революция открыла Локку дорогу к образованию. По рекомендации командира его отца полковника Александра Попхэма в 1646 году он был зачислен в Вестминстерскую школу. В 1652 году, когда Локк, один из лучших учеников школы, поступил в Оксфордский университет, он обращается со следующими словами к А. Попхэму «Вся нация смотрит на Вас как на защитника ее законов и свободы».
В 1655 году Локк получил степень бакалавра искусств, а через три года заслужил степень магистра.
В Оксфорде Локк сближается с энтузиастами нового научного направления, которое противостояло схоластической учености, господствовавшей в английских университетах. Еще до 1658 года он проявляет глубокий интерес к деятельности Джона Уилкинса, ученого «со страстью к научным экспериментам, невиданной в каком-либо человеке со времен Бэкона». Ричард Лоувэ, сторонник экспериментального изучения причин заболеваний, впервые применивший переливание крови, увлекает Локка занятиями медициной. Здесь же, в Оксфорде, Локк становится другом Роберта Бойля и совместно с ним проводит естественнонаучные эксперименты. Бойль впервые пробудил у него интерес к философии Декарта и Гассенди.
В это же время Джона занимает вопрос об отношениях церкви к государству. Локк посвятил этому предмету свое первое сочинение, которое, впрочем, никогда не было напечатано. В 1664 году Локк в качестве секретаря сопровождал в Берлин английского посла Вальтера Фена. Из писем его к друзьям следует, что он отправился в Берлин скорее в качестве туриста и не помышлял о дипломатической карьере. Локк пробыл на континенте около года. В письмах друзьям Джон обстоятельно и живо описывал решительно все, что обращало на себя его внимание, начиная с положения финансов в Берлине и кончая крестинами одного новорожденного берлинца, на которых ему пришлось присутствовать.
В том же году Локк возвратился в Лондон. Занимаясь вопросом об отношении церкви к государству, Локк познакомился с влиятельными духовными лицами и близко сошелся с некоторыми из них. Один из его приятелей занял важный пост в Дублине и предложил ему видное место в духовной иерархии в Ирландии. Эта должность как нельзя более прельщала благочестивого Локка, но скромность заставила отказаться, он считал себя в то время недостаточно к ней подготовленным.
Постоянные заботы о собственном здоровье рано привели Локка к изучению медицины. По свидетельству современников, он вскоре стал искусным врачом, но, не желая заниматься медицинской практикой, давал советы только друзьям. Локк соблюдал строгую диету. Он пил только воду и считал это верным средством продлить жизнь.
В 1666 году Локк познакомился с лордом Энтони Эшли, страдавшим непонятной болезнью. Поставив точный диагноз, Локк посоветовал лорду сделать операцию и тем самым спас тому жизнь. В знак благодарности лорд Эшли пригласил Локка погостить к себе на лето, а потом предложил ему поселиться в его доме навсегда. Локк принял это предложение и продолжал лечить лорда и всех членов его семьи. Обязанности домашнего доктора не мешали Локку продолжать занятия философией и естественными науками. Благодаря Энтони Эшли Джон заинтересоваться политикой и теологией. Одновременно продолжал заниматься наукой. В 1668 году Локка избирают членом Королевского естественнонаучного общества, а в 1669 году — членом Совета этого общества.
В конце 1667 года он пишет Бойлю: «Место, которое я теперь занимаю, удержало меня от совершения каких-либо дальнейших химических экспериментов, хотя я чувствую, что у меня руки чешутся, чтобы еще позаниматься этим делом». После знакомства и сближения с выдающимся врачом-новатором Томасом Сиднхэмом он начинает писать трактат «О медицинском искусстве» (1669), в котором приводит доводы в защиту экспериментального исследования заболеваний. Правда, этот трактат не был закончен.